Una investigación sobre la eliminación de ciprofloxacina y norfloxacina mediante ficorremediación con énfasis en la toxicidad aguda y la composición bioquímica.

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 13911 (2023) Citar este artículo

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La ciprofloxacina (CIP) y la norfloxacina (NOR) pertenecen a la clase de contaminantes emergentes que se detectan con frecuencia en el medio acuático como una mezcla binaria, responsable del desarrollo de genes y bacterias resistentes a los antibióticos. Este estudio tiene como objetivo investigar cinco especies diferentes de algas Chlorella vulgaris (Cv), Chlorella pyrenoidosa (Cp), Scenedesmus obliquus (So), Tetradesmus sp (T) y Monoraphidium sp (M) por su tolerancia y eliminación de mezclas binarias. En este estudio se informan por primera vez los efectos sobre la composición bioquímica de las especies de algas en relación con la mezcla binaria y su eficiencia de eliminación. Los valores de toxicidad aguda (96 h EC50) están en el orden de So > Cp > T > M > Cv, Chlorella vulgaris es la especie de alga más sensible con 17,73 ± 0,24 mg/L y Scenedesmus obliquus es la especie de alga menos sensible con 39,19 ± 0,79 mg/l. Se encontró que la eficiencia de eliminación de la mezcla binaria era del orden de So > Cp > T > M > Cv, Scenedesmus obliquus eliminó CIP (52,4%) y NOR (87,5%) con la biodegradación como el principal mecanismo de eliminación que contribuyó. Además, se detectaron productos biotransformados menos tóxicos en Scenedesmus obliquus y la caracterización bioquímica reveló que el efecto estimulante del crecimiento es mayor, siendo los lípidos (35%), los carbohidratos (18%) y las proteínas (33%) los que proporcionan una ventaja en la producción de biomasa valiosa.

El consumo mundial de antibióticos ha aumentado de 635 a 674 unidades por 1.000 habitantes en los países desarrollados y de 1.490 a 1.593 unidades en los países en desarrollo1. Los estudios han informado que entre el 50% y el 80% de los antibióticos administrados se excretan a través de las heces y la orina como compuesto original y llegan al ambiente acuático, lo que ha llevado al desarrollo de genes resistentes a los antibióticos (ARG) que han generado preocupación en la salud pública a nivel mundial2 . ARG ha provocado la muerte de 25.000 niños en los países de la Unión Europea, 23.000 niños en los EE.UU. y 58.000 niños en la India cada año3,4. Las aguas residuales municipales son la principal fuente de contaminación por antibióticos en comparación con las aguas residuales hospitalarias. Las plantas de tratamiento de aguas residuales (EDAR) no están diseñadas para eliminar estos contaminantes, ya que el análisis metagenómico ha revelado que en las EDAR de 60 países tienen una distribución divergente de ARG5,6,7. India tiene la tercera industria farmacéutica activa más grande, que satisface el 50% de la demanda de medicamentos genéricos a nivel mundial y es uno de los cinco principales países consumidores de productos farmacéuticos, y se prevé que tendrá un aumento del 84% para 20308,9. La fluoroquinolona (FQ) pertenece al tercer antibiótico más grande, representa el 17 % del mercado mundial y es una clase importante de antibióticos que se ha utilizado ampliamente para tratar infecciones respiratorias y urinarias10,11. La ciprofloxacina (CIP) y la norfloxacina (NOR) son las FQ detectadas con mayor frecuencia en aguas superficiales, superando una tasa de detección del 50% a nivel mundial debido a su uso excesivo y se han detectado en diferentes concentraciones que van desde ng/L hasta µg/L12.

Se pueden emplear varios métodos de tratamiento convencionales y avanzados para el tratamiento de estos contaminantes, pero los altos costos de operación y mantenimiento restringen su utilización en las EDAR municipales. La mineralización incompleta de estos contaminantes genera productos transformados que son tóxicos para la comunidad acuática y se ha convertido en una gran preocupación6. La biodegradación por microorganismos es un buen enfoque en el tratamiento de estos contaminantes con la ventaja de ser respetuoso con el medio ambiente y rentable12,13. Las FQ no son fácilmente biodegradables en las EDAR convencionales, pero cuando se tratan con especies microbianas específicas, las FQ pueden tratarse biológicamente14. Las algas no son organismos objetivo de los antibióticos y se sabe que tratan las aguas residuales eliminando eficazmente nutrientes, contaminantes orgánicos y metales pesados con la ventaja de la producción de biomasa6,15. CIP y NOR se prueban para la ficorremediación y los estudios han demostrado la capacidad de las especies de algas para biodegradar los contaminantes individualmente16,17,18,19. Chlorella vulgaris (Cv), Chlorella pyrenoidosa (Cp) y Scenedesmus obliquus (So) han demostrado su potencial para eliminar CIP, 85 % (Cv), 79 % (Cp) y 75 % (So) y para NOR, 52 %. (Cv), 50% (Cp) y 43% (So) con concentración inicial CIP (0,029 µg/L) y NOR (0,032 µg/L) por separado20. CIP y NOR se han detectado en las aguas superficiales de la India como una mezcla binaria con la concentración máxima detectada de 6,5 mg/L (CIP) y 0,52 mg/L (NOR)21.

Estudios de evaluación de toxicidad individuales han informado que un aumento en la concentración de contaminantes inhibirá el crecimiento de algas y esto tendrá un impacto en su eliminación y composición bioquímica16,22. La CE50 (concentración a la que se inhibe el 50% de la tasa de crecimiento de las algas) es la evaluación más aceptada para la evaluación de la toxicidad en especies de algas23. También existen otras especies de algas como Tetradesmus sp (T) y Monoraphidium sp (M) que requieren mucha atención en estudios de ficorremediación para la eliminación de antibióticos. Tetradesmus sp (T) y Monoraphidium sp (M) han mostrado buenas propiedades de ficorremediación y tienen el potencial de producir biomasa valiosa con buenas propiedades bioquímicas24,25,26,27, pero ambas especies aún no han sido probadas para determinar su potencial en la eliminación. de preguntas frecuentes. El potencial de ficorremediación puede verse aturdido cuando los valores de la prueba son superiores a EC50. Por lo tanto, se debe realizar una prueba de inhibición del crecimiento antes de emplear las algas para la eliminación de contaminantes, ya que se sabe que los contaminantes tóxicos inhiben el crecimiento de las algas. Estos resultados contribuirán a que se puedan identificar los datos de toxicidad de las FQ sobre estas especies seleccionadas y la aplicación de estas especies en plantas de tratamiento de aguas residuales.

La mayoría de los estudios se han centrado en la evaluación individual de la CE50 y la eliminación de contaminantes, sin ninguna información sobre sus efectos sobre la composición bioquímica (proteínas, carbohidratos y lípidos)16,17,28,29. En el caso de una mezcla binaria (CIP+NOR) aún no se ha reportado evaluación de toxicidad aguda, remoción y sus productos biotransformados, ya que la combinación de estos contaminantes existe en el ambiente. Con esto en vista, este estudio tiene como objetivo seleccionar y seleccionar las especies de algas más efectivas y tolerantes entre las cinco algas diferentes que representan cuatro géneros diferentes (Cv, Cp, So, T y M), para evaluar la toxicidad aguda de mezclas binarias y sus efectos sobre la composición bioquímica (proteínas, carbohidratos y lípidos) en las especies de algas seleccionadas, e investigar el potencial de eliminación de la mezcla binaria (CIP+NOR) y los mecanismos adaptados por las especies de algas para su eliminación, productos biotransformados y sus efectos sobre la composición bioquímica (proteínas, carbohidratos y lípidos).

Se prepararon soluciones madre de norfloxacina (NOR) (n.º CAS: 70458-96-7) y ciprofloxacina (CIP) (n.º CAS: 85721-33-1) con > 98 % de pureza (grado HPLC) disolviendo CIP y NOR en el agua ultrapura y se almacenó en un recipiente hermético de vidrio Schott a 4 ° C en condiciones de oscuridad durante no más de 7 días.

Las concentraciones de CIP y NOR se determinaron de acuerdo con el suplemento USP 28-NF 23 s utilizando cromatografía iónica compacta UV-VIS 844 equipada con una columna de HPLC (Hichrom-Alltima 5 µm C-18 con dimensiones 250 × 4,6 mm)30,31,32 . Como fase móvil se utilizó acetonitrilo (15%) y agua ultrapura (85%) con pH = 3,2 con un caudal ajustado a 1 ml/min y un volumen de inyección de 250 µL19. La longitud de onda del detector UV se configuró en 280 ± 5 nm, lo que corresponde a la longitud de onda máxima tanto para los antibióticos como para el tiempo de retención para NOR fue de 14,5 min y para CIP de 16,5 min, respectivamente. El límite de detección de CIP y NOR en este estudio fue de 0,03 µg/L y 0,02 µg/L, respectivamente. La concentración se estimó utilizando el software IC-NET 2.3 integrado con el equipo de HPLC y, al finalizar el análisis, se trazaron las curvas de superposición consolidadas del análisis individual utilizando el software IC-NET. Los productos biotransformados se identificaron mediante espectrometría de masas en tándem de cromatografía líquida-ionización por pulverización de electrones. Como fase móvil se utiliza ácido fórmico (0,1%) y acetonitrilo en una proporción volumétrica (95:5). Las condiciones del espectrómetro de masas y los detalles de la columna se presentan en otra parte33.

Chlorella vulgaris (Cv) (BDU-GD003) se adquirió del Repositorio Nacional de Microalgas y Cianobacterias (NRMC), Universidad de Bharathidasan, Tamilnadu, India. Chlorella pyrenoidosa (Cp) (NCIM-2738), Scenedesmus obliquus (So) (NCIM-5586), Tetradesmus sp (T) (NCIM-5797) y Monoraphidium sp (M) (NCIM-5792), se adquirieron del National Colección de Microorganismos Industriales (NCIM), Pune, India. Todos los cultivos adquiridos se subcultivaron en medio BG-11 en condiciones estériles en una cámara de crecimiento de algas con una intensidad de luz de 50 µmol fotón/m2/s en un ciclo de luz y oscuridad de 12 h a 27 °C hasta que finalizó su fase de crecimiento. alcanzado.

La densidad celular (células/mL) se midió usando un hemocitómetro mejorado de Neubauer con un aumento de microscopio trinocular de 40 × y la tasa de crecimiento específica (μ) se calculó usando la siguiente ecuación. (1)34.

donde Ci y Cf son la densidad celular medida en el momento inicial (ti) y final (tf).

Se recolectaron 2 ml de células de algas centrifugando las células a 5000 rpm durante 10 minutos a partir de las ejecuciones experimentales. El sobrenadante se descartó y se resuspendió con 5 mL de metanol al 90% y se incubó a 60 °C durante 5 min y luego se centrifugó nuevamente durante 10 min. Los sobrenadantes se recogieron en tubos separados y se midieron las densidades ópticas para longitudes de onda de 665, 652 y 470 nm usando un espectrofotómetro UV-visible, y la concentración del pigmento extraído se calculó usando las siguientes ecuaciones. (2)–(4)16.

Las proteínas, los carbohidratos y los lípidos son las tres composiciones bioquímicas importantes de las algas. Las muestras recolectadas de las corridas experimentales se sometieron a centrifugación para extraer los sedimentos celulares del medio de algas35. Los sedimentos celulares recolectados se sometieron al método de Lowry para extraer la proteína de los sedimentos celulares recolectados y se cuantificaron usando albúmina sérica bovina como estándares en un espectrofotómetro UV-visible36. Se usó el método Anthrone para extraer los carbohidratos de los sedimentos celulares recolectados y se cuantificaron. utilizando glucosa como estándares en un espectrofotómetro UV-visible36. Los lípidos se extrajeron mediante el método de sonicación y se cuantificaron gravimétricamente36,37. El peso seco de las células (DCW) se calculó gravimétricamente secando los sedimentos celulares recolectados. Los lípidos, proteínas y carbohidratos se expresaron en porcentajes a partir de la biomasa recolectada utilizando las siguientes ecuaciones. (5)–(7)35.

Los experimentos de toxicidad aguda se realizaron según las directrices 201 de la OCDE23. Se utilizaron diferentes concentraciones de CIP y NOR que oscilaban entre 1 y 100 mg/L para las pruebas individuales, y se agregaron proporciones iguales de CIP+NOR de concentraciones fijas de (1:1) que oscilaban entre 1 y 50 mg/L en los 100 ml. medio de algas. La densidad celular inicial para todos los experimentos se mantuvo en 100 × 104 células/ml. Se incubaron tres réplicas de pruebas (con contaminantes) y pruebas de control (sin contaminantes) en la cámara de crecimiento de algas equipada con un agitador orbital (120 rpm) para la prueba de inhibición del crecimiento. El porcentaje de inhibición (%I) se calculó utilizando la siguiente ecuación. (8)38.

donde \(\mu c\) y \(\mu t\) son la densidad celular medida en la ejecución de control y la ejecución de prueba.

EC50 es la concentración eficaz que inhibe el 50% del crecimiento de algas. Se trazó una curva dosis-respuesta utilizando el porcentaje de inhibición (%I) calculado para diferentes concentraciones. Para encontrar la linealización de EC50, se necesitan los datos de respuesta para realizar el análisis de regresión. Se realizó un análisis estadístico Probit para linealizar los datos según las directrices OCDE 20123 para calcular CE50. Los valores de CE50 de los productos biotransformados se predijeron utilizando el software ECOSAR (versión 2.2)39.

Los cocientes de riesgo (RQ) intentan estimar el riesgo potencial para las algas causado por la concentración máxima ambiental detectada. RQ se calcula mediante las siguientes ecuaciones. (9) y (10) 40.

donde MEC se mide como concentración ambiental, PNEC se predice como concentración sin efecto.

Cuando se calcula

RQ > 1 indica que existe un riesgo ecotoxicológico para las especies de algas.

RQ < 1 indica que no hay riesgo para las especies de algas.

Se realizó una serie de corridas experimentales con cinco especies de algas diferentes con corridas de control (sin CIP + NOR) y corridas de prueba (con CIP + NOR) en matraces Erlenmeyer de 250 ml que contenían 100 ml de medio de algas con una densidad celular inicial promedio de 100 × 104 células/ml. CIP (6,5 mg/L) y NOR (0,5 mg/L) se agregaron en las pruebas. Se incubaron experimentos duplicados en la cámara de crecimiento de algas equipada con un agitador orbital (120 rpm) con una intensidad de luz de 50 µmol fotón/m2/s en un ciclo de 12 h de luz y 12 h de oscuridad a T = 30 °C ± 1 °C hasta que la fase de crecimiento descendió a la fase de muerte. Se recolectan 5 ml de muestra de las series experimentales y se centrifugan durante 10 minutos a 2500 rpm para determinar la eliminación total de CIP+NOR que se calcula mediante la siguiente ecuación. (11)19.

donde Ci es la concentración inicial de (CIP+NOR) en el medio y Cf es la concentración residual de (CIP+NOR).

La bioadsorción, la bioacumulación y la biodegradación son los tres principales mecanismos de eliminación adoptados por las algas en la eliminación de antibióticos41. La bioadsorción (Rad) se determina mediante el método de centrifugación de alta velocidad aumentando las rpm de 2500 a 5000 rpm sin alterar la pared celular19,42,43. El sobrenadante recogido se utilizó para la determinación de Rad. La bioacumulación (Rac) se determina mediante el método de ultrasonicación19,44. Después de 30 min de sonicación, la muestra se centrifuga durante 10 min a 2500 rpm y el sobrenadante se utiliza para la determinación de Rac. La biodegradación (Rb) se calcula utilizando la siguiente ecuación. (12)19.

La eliminación abiótica (fotodegradación) se determina manteniendo las series de control sin algas en condiciones de luz y oscuridad durante un período de 7 días) y se calcula utilizando la siguiente ecuación. (12). Dado que se sabe que los FQ son compuestos fotosensibles, la Ec. (13)17,19,45.

La Figura 1 muestra la metodología general seguida en este estudio.

Metodología seguida en este estudio.

El estudio de inhibición del crecimiento se realizó por triplicado y el análisis Probit para EC50 se calculó utilizando el software SPSS (versión 26). El estudio de eliminación se realizó por duplicado y los valores medios se presentaron como resultados. Se realizó un ANOVA unidireccional junto con la prueba de Dunnett para encontrar la significancia estadística (p <0,05) entre las ejecuciones de control y las ejecuciones de prueba en el estudio experimental. El análisis estadístico y el trazado de gráficos se llevaron a cabo utilizando el software Origin Pro (versión 9.9). Las estructuras químicas se representaron utilizando Chemdraw (versión 20.0).

Se realizó una evaluación de la toxicidad aguda de CIP, NOR y la mezcla binaria (CIP+NOR) sobre las especies de algas seleccionadas para comprender los efectos estimulantes e inhibidores del crecimiento que un contaminante objetivo puede causar individualmente y en forma combinada. La Figura 2 muestra la curva dosis-respuesta para CIP, NOR y CIP+NOR. La mayor inhibición del crecimiento para CIP se registró para Monoraphidium sp (M), 78,6%, seguido de 67,6% (Cv), 65,1% (Cp), 62,6% (T) y 61% (So). Para NOR, la mayor inhibición del crecimiento del 73,6% se registró para Chlorella vulgaris (Cv), seguida de 72,6% (T), 65,6% (M), 60,4% (Cp) y 56,9% (So). Para la mezcla binaria, la mayor inhibición del crecimiento se observó en Chlorella vulgaris (Cv) 73,33%, seguida de 72,5% (M), 66,6% (Cp), 63% (T) y 49,8% (So). Los valores de CE50 se calcularon utilizando el análisis estadístico Probit de las ejecuciones experimentales (CIP, NOR y CIP + NOR) y se tabularon en la Tabla 1. Los valores de CE50 de 96 h están en el orden de (So) > (T) > (M) > (Cp) > (Cv) para CIP, (So) > (Cp) > (M) > (T) > (Cv) para NOR, y (So) > (Cp) > (T) > (M) > (Cv) para CIP+NOR. Cuanto mayor sea el EC50, mayor será su tolerancia hacia el contaminante específico. A partir de los valores de EC50, la PNEC y los RQ se calcularon y tabularon en la Tabla 1.

Dosis: curva de respuesta de inhibición del crecimiento (%) para (a) CIP, (b) NOR, (c) CIP+NOR para especies de algas.

La Comisión de las Comunidades Europeas (directiva UE 93/67/CEE) clasifica el contaminante en la categoría “nocivo” para el organismo acuático cuando el valor EC50 calculado se encuentra dentro del rango de (10–100 mg/L)46. Si bien se clasifican las especies de algas según los valores EC50 calculados y los valores RQ, los resultados indican que CIP+NOR es dañino y presenta un alto riesgo para las especies de algas. Los resultados de la evaluación individual de la toxicidad aguda también afirman que representa una amenaza para las especies de algas incluso cuando están presentes en forma separada. Los estudios realizados para la prueba de inhibición del crecimiento EC50 para CIP y NOR también afirman que los valores caen dentro de la categoría nociva para Chlorella vulgaris (CIP-96 h EC50 < 100 mg/L)47,48 y (NOR-72 h EC50 < 100 mg/ L)49.

Los efectos inhibidores aumentaron. La evaluación de la toxicidad aguda de CIP+NOR aumentó debido a la toxicidad combinada. Un estudio realizado por Magdaleno et al.40 informó que la inhibición del crecimiento causada por la mezcla binaria (ciprofloxacina y cefalotina) para el alga Pseudokirchneriella subcapitata es mayor que la inhibición del crecimiento individual y los resultados obtenidos en este estudio están en línea con la literatura reportada.

Se sabe que la respuesta a los contaminantes en las especies de algas varía según sus características fisiológicas, morfológicas, citologías y filogenéticas22. Los efectos inhibidores variaron según las especies y su tolerancia hacia los contaminantes, ya que la mezcla binaria tuvo un grave impacto en sus niveles de inhibición. Scenedesmus obliquus (So) es la especie de alga menos sensible a los efectos tóxicos de los antibióticos (CIP, NOR y CIP+NOR), mientras que Chlorella vulgaris (Cv) es la especie más sensible entre las especies de algas seleccionadas. No se han informado datos de toxicidad para Chlorella pyrenoidosa (Cp), Scenedesmus obliquus (So), Tetradesmus sp (T) y Monoraphidium sp (M) para CIP, NOR y CIP+NOR. Por lo tanto, estos resultados contribuyen a los datos de toxicidad de las FQ en estas especies seleccionadas.

La clorofila es un importante pigmento captador de luz involucrado en la fotosíntesis y se sabe que la exposición a contaminantes altera la síntesis de chl-a y chl-b47,50. Durante la exposición de las algas al estrés ambiental, se sabe que los carotenoides actúan como un mecanismo protector del fotosistema y desempeñan un papel crucial en la extinción del oxígeno singlete al desactivar la clorofila activa51. Los pigmentos chl-a, chl-b y carotenoides extraídos de las especies de algas se representaron gráficamente para estudiar los efectos binarios de CIP+NOR sobre pigmentos en diferentes concentraciones, como se muestra en la Fig. 3. El efecto varió según la sensibilidad de las algas. especies, así como la concentración de los contaminantes. Se observa que en las especies de algas Chlorella pyrenoidosa (Cp) y Scenedesmus obliquus (So), hay un aumento en la actividad del pigmento en concentraciones <10 mg/L (Fig. 3b,c) y la concentración de carotenoides aumentó hasta su correspondiente Los niveles de EC50 como respuesta al estrés y luego disminuyeron significativamente al 11% (So) y al 13% (Cp) a una concentración de 50 mg/L, lo que indica el daño a las células de las algas a medida que aumenta la concentración.

Efecto de la mezcla binaria (CIP+NOR) sobre chl-a, chl-b y carotenoides para (a) Cv, (b) Cp, (c) So, (d) T y (e) M.

En Tetradesmus sp (T) se observó la misma actividad en pigmentos hasta 5 mg/L (Fig. 3d) y el contenido de carotenoides disminuyó hasta un 27% a una concentración de 50 mg/L. En Monoraphidium sp (M) se observó un aumento de la actividad del pigmento en concentraciones <2,5 mg/L (Fig. 3e) y el contenido de carotenoides disminuyó hasta un 47% en una concentración de 50 mg/L y para Chlorella vulgaris (Cv), aumento de chl-a. y la actividad de chl-b se observó a 1 mg / L (Fig. 3a), siendo la especie de algas más sensible entre las especies de algas seleccionadas. La concentración de carotenoides disminuyó gradualmente hasta un 50 % a una concentración de 50 mg/l, lo que indica daño a las células. Los resultados del presente estudio concuerdan con los estudios realizados sobre Chlamydomonas mexicana16, Chlamydomonas reinhardtii51 y Scenedesmus obliquus42 que afirman que el estrés tóxico puede alterar la actividad de los pigmentos según su concentración expuesta en el medio y dificultar la actividad fotosintética en las células de algas.

Después de 96 h de exposición a las diversas concentraciones de CIP+NOR para las especies de algas seleccionadas, la secreción de la concentración de proteínas, lípidos y carbohidratos varió según las especies de algas. La Figura 4 muestra el efecto de diferentes concentraciones de la mezcla binaria (CIP+NOR) sobre las proteínas, los lípidos y los carbohidratos en las especies de algas seleccionadas (Cv, Cp, So, T y M) para sus ejecuciones de control, respectivamente. Los efectos estimulantes del crecimiento se observaron en todas las especies de algas seleccionadas dentro de su valor de CE50 calculado a las 96 h. Para Chlorella vulgaris (Cv) y Chlorella pyrenoidosa (Cp), se observaron efectos estimulantes del crecimiento por debajo de su valor de CE50 (< 25 mg/L). Se observaron efectos inhibidores cuando la concentración aumentó más allá del valor de CE50. La acumulación de proteína ha disminuido drásticamente en todas las concentraciones en comparación con las series de control. La acumulación máxima de lípidos para Chlorella vulgaris (375 mg/L) se informó en 1 mg/L y para Chlorella pyrenoidosa (646 mg/L) en 5 mg/L. En nuestro estudio anterior19, cuando Chlorella vulgaris fue expuesta a CIP (5 mg/L), se observaron efectos estimulantes del crecimiento con una mayor acumulación de lípidos (465 mg/L), carbohidratos (39 mg/L) y proteínas (608 mg/L). /L) que lo informado en este estudio. La disminución de la composición bioquímica en este estudio se atribuye a la toxicidad de la mezcla binaria.

Efecto de la mezcla binaria (CIP+NOR) sobre proteínas, lípidos y carbohidratos para (a) Cv, (b) Cp, (c) So, (d) T y (e) M.

Cuando Scenedesmus obliquus (So) fue expuesto a la mezcla binaria, la concentración de lípidos aumentó hasta 319 mg/L y luego disminuyó más allá de la concentración de CE50 (39 mg/L). Se observó un aumento en la concentración de proteínas a 1 mg/L y 2,5 mg/L y luego se redujo drásticamente en comparación con las pruebas de control, mientras que para los carbohidratos el valor disminuyó en todas las pruebas. Para Tetradesmus sp (T), hay una disminución gradual de proteínas y carbohidratos cuando aumenta la concentración de CIP+NOR pero la acumulación de lípidos fue mayor en todas las concentraciones. La acumulación máxima de lípidos de 290 mg/L se observó con 5 mg/L (CIP+NOR). En la especie Monoraphidium sp (M), a 1 mg/L de concentración CIP+NOR, se observó acumulación máxima de lípidos (296 mg/L) y proteínas (518 mg/L), mientras que para los carbohidratos los niveles disminuyeron en todas las especies. ejecuciones de prueba. La razón de este comportamiento en las células de las algas se debe a que durante la fotosíntesis el pigmento clorofila realiza la fijación de carbono y almacena energía en forma de almidón, pero cuando la actividad fotosintética de las algas disminuye la producción de carbohidratos también disminuye. Los resultados observados en el presente estudio son consistentes con el informe anterior sobre estrés antibiótico en algas52.

Se selecciona una mezcla binaria de CIP y NOR con concentraciones de 6,5 mg/L (CIP) y 0,5 mg/L (NOR) para los estudios de eliminación, ya que esta mezcla binaria en estas concentraciones se detecta en el ambiente acuático de la India21. Se sabe que el valor de CE50 aumenta cuando aumenta el tiempo de exposición, ya que se sabe que las algas se aclimatan a las condiciones tóxicas para sobrevivir en el ambiente acuático16. De los resultados de toxicidad aguda, podemos concluir que todas las especies de algas seleccionadas pueden tolerar esta concentración seleccionada de la mezcla binaria, el efecto estimulante del crecimiento en las algas puede permitir que las especies de algas eliminen la mezcla binaria del medio de algas. La Figura 5 muestra la experimentación seguida para la eliminación de CIP+NOR.

Experimentación para la eliminación de CIP+NOR.

La densidad de las células de las algas y la chl-a se controlaron todos los días hasta que las especies de algas alcanzaron la fase de muerte durante su crecimiento. La Figura 6 compara la fase de crecimiento de las especies de algas en las pruebas con las pruebas de control. La tasa de crecimiento específica para las series de control fue de 0,22 d-1 (Cv), 0,15 d-1 (Cp), 0,18 d-1 (So), 0,15 d-1 (T) y 0,14 d-1 (M), mientras que para En las pruebas se alcanzó 0,28 d-1 (Cv), 0,2 d-1 (Cp), 0,23 d-1 (So), 0,17 d-1 (T) y 0,19 d-1 (M). La tasa de crecimiento máxima se registró para (So) 0.65 d-1 durante el día 4 de su fase de crecimiento exponencial y la tasa de crecimiento más baja se observó en (Cv) (- 0.01 d-1) durante el día 6 (Fig. 6a). la tasa de crecimiento negativa indica la disminución de la densidad celular de las algas debido a la presencia de la mezcla binaria, lo que afirma la evaluación de toxicidad aguda de (Cv) siendo la especie más sensible y (So) siendo la especie más tolerante a la mezcla binaria de CIP. +NI. Se realizaron pruebas de Dunnett para comparar las ejecuciones de control y las ejecuciones de prueba en todas las ejecuciones experimentales para encontrar la significación estadística. Los valores de p generados fueron 0,04 (Cv), 0,03 (Cp), 0,03 (So), 0,02 (T) y 0,04 (M). los cuales fueron estadísticamente significativos al nivel (p < 0,05).

Efecto de la mezcla binaria (CIP+NOR) sobre la densidad celular y chl-a para (a) Cv, (b) Cp, (c) So, (d) T y (e) M.

El patrón de crecimiento y la actividad de chl-a de los resultados indican la capacidad de las algas para adaptarse a las condiciones de estrés causadas por la mezcla binaria de CIP+NOR. En todas las especies, la tasa de crecimiento y la chl-a fueron inhibidas durante los 2-3 días de su fase de crecimiento debido al estrés agudo. La densidad celular y la actividad de chl-a aumentaron después del día 3 más que en las pruebas de control, lo que afirma la respuesta estimulante del crecimiento de las especies de algas. Para Scenedesmus obliquus (So), la actividad fotosintética aumentó incluso en el día 7 (Fig. 6c), mientras que en otras especies la actividad de chl-a disminuyó, lo que confirma los resultados de la prueba inhibidora de que (So) se adapta mejor a las condiciones tóxicas que otras especies seleccionadas. .

La eliminación biótica (bioadsorción, bioacumulación y biodegradación) y la eliminación abiótica (fotodegradación) son las dos contribuciones principales a la eliminación de CIP+NOR en el medio. Se considera la eliminación abiótica para evaluar la eliminación biótica real por las algas en el medio. Se ha observado que la eliminación abiótica de NOR (10%) > CIP (1,9%) después de 7 días (Fig. 7f), lo que indica que NOR es más sensible a la fotodegradación en comparación con CIP45; sin embargo, la eliminación mediante condiciones abióticas es insignificante. en comparación con la eliminación biótica.

HPLC superpuso picos de detección de composición binaria (CIP+NOR) para (a) Cv, (b) Cp, (c) So, (d) T, (e) M y (f) eliminación abiótica.

La bioadsorción, bioacumulación y biodegradación son eventos simultáneos que ocurren en las células de las algas para la asimilación de contaminantes53,54. La bioadsorción es un mecanismo extracelular que depende de los grupos funcionales (proteínas, celulosa y hemicelulosa) seguido de bioacumulación donde las algas contrarrestan el estrés mediante la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS), lo que conduce al mecanismo de biodegradación en las algas53,54. Chl-a es un importante pigmento captador de luz; durante la fotosíntesis libera protones dentro de la célula, lo que mejora la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) para contrarrestar el estrés causado por el contaminante55. Esta ROS generada en la célula de alga participa en la degradación de los contaminantes que causan estrés en el medio de las algas56. La contribución de cada mecanismo en la eliminación de una mezcla binaria (CIP + NOR) se tabula en la Tabla 2. La Figura 7 muestra las curvas de picos superpuestas consolidadas registradas en el análisis de HPLC para la determinación del mecanismo de eliminación adaptado por diferentes especies de algas.

La eficiencia de eliminación de la mezcla binaria es del orden de So > Cp > T > M > Cv, que está en línea con el orden EC50 calculado de 96 h So > Cp > T > M > Cv. Para Chlorella vulgaris (Cv), la biodegradación (92%) es el principal mecanismo de eliminación que contribuye al CIP, pero la biodegradación de NOR es solo del 6% y el 19% de NOR se acumula dentro de la célula de alga. El valor de EC50 indicó que Cv es más sensible hacia CIP en comparación con NOR, para contrarrestar el estrés causado, la reducción de CIP (55%) > NOR (25%) en el medio algal. Contribución a la biodegradación para la eliminación de CIP + NOR, en Chlorella pyrenoidosa (Cp) CIP (88%) > NOR (67%), Scenedesmus obliquus (So) CIP (88%) > NOR (87%), Tetradesmus sp (T) CIP (72%) < NOR (82%), y para Monoraphidium sp (M) CIP (87%) > NOR (84%). Es interesante observar que el potencial de biodegradación de Monoraphidium sp (M) es mayor junto al Scenedesmus obliquus (So) a pesar de que los estudios de toxicidad aguda demostraron que es sensible a la mezcla binaria.

La contribución a la bioadsorción de NOR es mayor en la especie Chlorella, 31% (Cv) y 14% (Cp) que en otras especies. Esta actividad en las especies de Chlorella puede evaluarse mediante el valor de log Kow de NOR (0,46) que es superior al CIP (0,26), estudios han informado que cuanto mayor es el valor mayor es la adsorción de contaminantes en las células19,57. La contribución de bioadsorción (%) también puede variar según el potencial de asimilación y aclimatación de las especies de algas. En Tetradesmus sp (T), la contribución a la biodegradación de NOR es 82% > CIP (72%) y la bioacumulación de NOR está por debajo del límite de detección (BDL). En Scenedesmus obliquus (So), la contribución de bioadsorción para CIP es del 6% y NOR es de 0,39%, y se puede observar que la contribución a la biodegradación de NOR es del 87%, que es mayor que la de las otras especies probadas y la bioacumulación de NOR está por debajo de la deducción. límite del equipo. De los resultados obtenidos se desprende claramente que Scenedesmus obliquus es eficaz en la eliminación de CIP + NOR.

De los informes experimentales, se puede inferir que Scenedesmus obliquus tuvo un mejor desempeño en términos de tolerancia (96 h EC50) y eficiencia de eliminación. Los productos biotransformados dentro de Scenedesmus obliquus se evalúan mediante análisis LC-MS (Fig. 7) y la posible vía biotransformada se representa en la Fig. 8. Las ROS generadas dentro de las células de algas atacan la fracción quinolona (grupo carboxilo), átomo F. y piperazina para descomponer el compuesto original en menos tóxico como respuesta al estrés inducido por la mezcla binaria. La descomposición de piperazinilo por la enzima citocromo P450 y la defluoración junto con la fragmentación de C5H5N2 del CIP por las ROS dieron como resultado la formación de ácido 1-ciclopropil-4-oxo-1,4-dihidroquinolin-3-carboxílico (C1) y la degradación de el resto quinolina dio como resultado la formación de quinolin-4(1H)-ona (C2). 1-etil-4-oxo-1,4-dihidroquinolina-3-carbaldehído (N1) y 1-metilquinolin-4(1H)-ona (N2) son los dos productos biotransformados formados como resultado de la desetilación y defluoración del NOR en su interior. células de algas. La vía de degradación propuesta en la Fig. 8 es consistente con el estudio de la literatura58,59,60.

Posible vía de biotransformación de CIP+NOR en Scenedesmus obliquus.

ECOSAR se emplea para predecir la toxicidad aguda (96 h EC50) para productos biotransformados, C1 (866 mg/L), C2 (156 mg/L), N1 (185 mg/L) y N2 (71 mg/L). Los productos biotransformados fueron menos tóxicos en comparación con los compuestos originales debido a la pérdida del átomo de flúor y del anillo de piperazina de los compuestos, ya que estos sustituyentes contribuyen a la actividad antibacteriana de la fluoroquinolona61. La presencia de productos biotransformados inofensivos dentro de Scenedesmus obliquus indica el potencial de las algas para tratar estos compuestos tóxicos en matrices de aguas residuales sin la producción de subproductos tóxicos.

En todas las corridas experimentales, la acumulación de biomasa (peso seco de las células) fue mayor en las corridas de prueba que en las corridas de control. La evaluación de la composición bioquímica (carbohidratos, lípidos y proteínas) se tabuló en la Tabla 3. Se puede observar en la tabla que Scenedesmus obliquus (So) tiene un mayor contenido de lípidos (35%), carbohidratos (18%) y proteínas (33%). %) de acumulación en comparación con las series de control, lo que afirma la respuesta estimulante del crecimiento en la especie (So). En las especies de algas (Cv, Cp, T y M), al ser las especies sensibles a la mezcla binaria, la producción de proteína disminuyó en comparación con las corridas de control. Las células de algas convierten la fuente de carbono y el CO2 en gliceraldehídos-3-fosfato (G3P) durante la fotosíntesis mediante la acción de la actividad de chl-a62. G3P es responsable de la producción de proteínas, carbohidratos y lípidos acumulados dentro de la célula, especialmente las proteínas y los lípidos son el resultado de la generación de acetil-CoA y piruvato a partir de G3P, cuando se acumula un contaminante tóxico dentro de las células de las algas, las células contrarrestan las condiciones de estrés aumentando la producción de lípidos como mecanismo de defensa63. La mayor producción de lípidos que de proteínas en todas las especies de algas se debe al resultado del estrés inducido por CIP+NOR.

Comparar la composición bioquímica de la biomasa en todas las especies de algas. (So) tiene una mayor acumulación de lípidos con una buena eficiencia de eliminación y también puede tolerar el estrés causado por la mezcla binaria. Scenedesmus obliquus es el candidato más adecuado entre estas especies de algas probadas en el tratamiento de agua contaminada con antibióticos con la ventaja de una valiosa producción de biomasa.

En este estudio experimental, se realizaron pruebas inhibidoras para Chlorella vulgaris (Cv), Chlorella pyrenoidosa (Cp, Scenedesmus obliquus (So) y Tetradesmus sp (T) y Monoraphidium (M) añadiendo al medio de algas la mezcla binaria (CIP). +NOR). La evaluación de toxicidad aguda reveló que Scenedesmus obliquus es la especie de alga menos sensible con una inhibición del 49% a 50 mg/L. Además, los estudios de eliminación revelaron que Scenedesmus obliquus tuvo un mejor desempeño en la eliminación de ambos contaminantes con la biodegradación como principal mecanismo de eliminación. –Los resultados de MS revelaron que los productos biotransformados son menos tóxicos que el compuesto original. El análisis de la composición bioquímica (proteínas, carbohidratos y lípidos) reveló que el efecto estimulante del crecimiento se observó mayor en (So), este efecto aporta una ventaja en la utilización de la biomasa después de la Tratamiento para la producción de bioproductos con valor añadido.

Scenedesmus obliquus no se puede emplear cuando la concentración de la mezcla binaria en el medio es superior a su nivel de tolerancia. Sin embargo, existe la necesidad de optimizar y evaluar el desempeño de Scenedesmus obliquus en un estudio a escala piloto (condiciones reales de las aguas residuales). Además, es necesario investigar la formación de productos biotransformados en presencia de otros contaminantes en las aguas residuales reales.

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo.

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Departamento de Ingeniería Ambiental y de Recursos Hídricos, Escuela de Ingeniería Civil, Instituto de Tecnología de Vellore (VIT), Vellore, 632014, India

ricky

Centro para un Medio Ambiente Limpio, Instituto de Tecnología de Vellore (VIT), Vellore, 632014, India

S. Shanthakumar

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RR: Análisis formal, Investigación, Figuras, Escritura—borrador original y revisado. SS: Metodología, Supervisión, Conceptualización, Redacción—Revisión y Edición.

Correspondencia a S. Shanthakumar.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Ricky, R., Shanthakumar, S. Una investigación sobre la eliminación de ciprofloxacina y norfloxacina mediante ficorremediación con énfasis en la toxicidad aguda y la composición bioquímica. Informe científico 13, 13911 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-41144-y

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Recibido: 27 de diciembre de 2022

Aceptado: 22 de agosto de 2023

Publicado: 25 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-41144-y

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